Бърз, високочувствителен, RT-LAMP и CRISPR/Cas12a анализ на място за откриване на SARS-CoV-2

В скорошно проучване, публикувано в Изследователски площад* сървър за препринт, изследователите използваха изотермично усилване с групирани, редовно разположени къси палиндромни повторения (CRISPR) -Cas12a за откриване на тежък остър респираторен синдром на коронавирус 2 (SARS-CoV-2).

Проучвания: Бързо, мултиплексно откриване на SARS-CoV-2 с помощта на изотермично усилване, съчетано с CRISPR-Cas12a. Кредит на изображението: creativeneko / Shutterstock

Заден план

Към днешна дата има над 546 милиона потвърдени случая на коронавирусна болест 2019 (COVID-19), включително 6,33 милиона смъртни случая в световен мащаб. За борба с пандемията са използвани количествени диагностични тестове за полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция (RT-PCR); тези тестове обаче изискват професионална намеса, както и специализирано оборудване, което прави тестовете скъпи. Алтернативен диагностичен подход, включващ медиирана от бримка изотермична амплификация (LAMP) заедно със стъпка на обратна транскрипция (RT-LAMP), която допълнително е съчетана с CRISPR / Cas, може да преодолее проблемите, подчертани от RT-qPCR.

Относно проучването

В настоящото проучване изследователите изследваха силно чувствителна, бърза RT-LAMP на място, съчетана с CRISPR / Cas12a анализ за откриване на SARS-CoV-2.

Екипът имаше за цел да постигне ниска чувствителност чрез комбиниране на RT-LAMP чрез едновременно откриване на различни целеви места, присъстващи в генома на SARS-CoV-2, използвайки системата CRISPR / Cas12. Границата на откриване на вируси беше увеличена чрез изследване на добавки като гуанидин хидрохлорид (GndHCL), което увеличи скоростта на реакцията и специфичността на взаимодействието праймер-мишена.

Освен това екипът дефинира компонентите на комплекта, участващи в откриването на контроли на синтетична рибонуклеинова киселина (РНК), използвайки CRISPR / Cas12a и тества амплификацията на отделни гени. Успехът на анализа за амплификация се оценява чрез оценка на флуоресценцията на интеркалиращото багрило. Впоследствие екипът преведе резултатите от откриването с клинични проби, за да оцени ефективността на подхода за откриване.

Резултати

Резултатите от проучването показаха, че откриването на SARS-CoV-2 от RT-LAMP разкрива, че наличните в търговската мрежа системи за откриване са постигнали забележителен отговор от 30 копия на withL с голяма вероятност за получаване на фалшиво положителни резултати. Екипът също така забеляза, че тези търговски комплекти са склонни към повтарящо се поведение при включване и изключване в отговор на по-голям или по-нисък брой копия. По-специално, тези комплекти не успяха да постигнат достатъчната граница на откриване и желаната специфичност.

Екипът също така забеляза, че търговските комплекти имат положително усилване на 10 минути в присъствието на положителни контроли и висок вирусен товар. Въпреки това, чувствителността, показана от тези комплекти, беше недостатъчна и не доведе до последователно откриване на SARS-CoV-2 в проби с по-нисък вирусен товар. Това предполага, че амплификацията произвежда малки количества усилен материал, не в достатъчна степен.

Реакцията RT-LAMP беше допълнена с Bst 2.0 полимераза за подобряване на скоростта на реакцията с усилване от 1 копие на µL. Добавянето на добавката намалява началото на амплификацията в случай на проби с по-висок вирусен товар и също така намалява границата на откриване.

Когато екипът използваше по-малко оптимизирана реакция като добавка към Cas12a, сигналът в крайната точка беше много нисък без насищане. Откриването на РНК контроли с помощта на CRISPR / Cas12a доведе до приблизително 10-кратно подобрение на сигнала в крайната точка за мултиплексни реакции и двукратно увеличение в случай на отделни реакции. Докато усилването на отделен ген води до умерено положителен сигнал в случай на висок вирусен товар, комбинирането на множество компоненти направи реакцията значително по-стабилна, с краен сигнал, който беше пет пъти по-висок от този, получен в първоначалната реакция. Екипът отбеляза, че тази комбинация от CRISPR / Cas12a-базирано откриване на множество водещи РНК показва по-ниски или сравними граници на откриване с наличните в търговската мрежа тестове.

Анализът на кривите на топене на амплифицираните продукти показа, че денатурацията на двуверижната дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК), генерирана от RT-LAMP, се увеличава с повишаване на температурата. Денатурираната ДНК се разделя на едноверижна ДНК, което води до намаляване на интензитета на флуоресценция. Екипът оцени силата на водородните връзки на произведения вирусен фрагмент, специфичен за SARS-CoV-2.

Освен това и двата отделни гена, а именно Orf1 генът и мултиплексът, бяха амплифицирани и имаха специфични точки на топене без неспецифична амплификация. По-ниските количества копия произвеждат по-малко ампликони, съответстващи на всички гени. При мултиплексния подход екипът отбеляза, че е по-лесно да се идентифицират по-ниски количества копия поради едновременното усилване на отделни гени, които произвеждат различни флуоресцентни сигнали. Сред 75 проби, преведени, за да се разбере ефективността на метода за тестване, 25 проби бяха положителни за SARS-CoV-2, а 50 бяха отрицателни.

Заключение

Като цяло резултатите от проучването показват, че методите за изотермично усилване позволяват изключително чувствително тестване на място в среда с ниски ресурси в сравнение с тази, показана от тестовете за антиген. Изследователите вярват, че методът на тестване може да послужи като основа за разработване на нови методи за откриване на вирусни инфекции и други патогени.

* Важно съобщение

Research Square публикува предварителни научни доклади, които не са рецензирани и следователно не трябва да се считат за убедителни, насочващи клиничната практика/поведение, свързано със здравето, или третирани като установена информация.

.

Leave a Comment