Използване на флуоресцентни промотор-репортери за изследване на контрола върху използването на захар в Bifidobacterium longum NCC 2705

Плазмидни конструкции

Интензитетът на различни аеробни и анаеробни флуоресцентни протеини е тестван в B. longum NCC 2705. Плазмид pMDY2324 и неговите производни, кодиращи GFP (pVG-GFP), YFP (pVG-YFP), CFP (pVG-CFP) и mCherry (pVG-mCherry) под контрола на силните B. bifidum Ппразнина промотор бяха щедро осигурени от Dr. Кристиан Ридел (Улмски университет, Германия) (Таблица S1)33. Кодиращите последователности за три различни циан-зелени анаеробни флуоресцентни протеина (Bs1, Bs2 и Pp1) са получени от Evocatal GmbH (Дюселдорф, Германия). Кодон оптимизирани (за експресия в бифидобактерии) варианти на тези гени бяха синтезирани (Thermo Fisher Scientific / Geneart GmbH, Регенсбург, Германия) и клонирани под контрола на Pпразнина промотор чрез заместване на кодиращия регион на mCherry (обхванат между XhoI и SacII рестрикционни сайтове) на pVG-mCherry, като се получава pSDU01празнина-Bs1), pSDU02 (Pпразнина-Bs2) и pSDU03 (Pпразнина-Pp1) (Таблица C1).

Флуоресцентните протеини Pp1 и mCherry бяха субклонирани под контрола на по-рано описания индуцируем от рафиноза промотор, предшестващ BL1518 в B. longum NCC 2705 (стрBL1518; координати на генома 1,692,388 до 1,692,679)24. ПBL1518 фрагменти, съдържащи различни рестрикционни места във всеки край, бяха синтезирани и клонирани пред mCherry и Pp1 кодиращи гени (виж pVG-mCherry плазмидна карта, Фиг. S1) (Thermo Fisher Scientific / Geneart GmbH). За mCherry това беше постигнато чрез замяна на BglII-MscI Pпразнина промоторен фрагмент в pVG-mCherry от подобно усвоения PBL1518 фрагмент, даващ pSDU12 (PBL1518-mCherry). По същия начин, ПBL1518 е използван за замяна на Pпразнина регион в pSDU03, използвайки BglII-BclI сайтове за клониране, генерирайки pSDU15 (PBL1518-Pp1) (Thermo Fisher Scientific / Geneart GmbH) (Таблица S1). Два плазмида, кодиращи β-глюкоронидаза под контрола на PпразнинапразнинаgusA; pMDY2333) и индуцируемият с рафиноза PBL1518BL1518gusA; pGUSC24) бяха използвани като контроли (Таблица S1).

Промоторът, предшестващ гена, кодиращ алдоза-1-епимераза (PBL1359; геномни координати 262,095 до 261,970; обърната последователност) и промотора отпред на BL1694 ген, кодиращ предложения пентозо-свързващ протеин (PBL1694; геномни координати 2,114,397 до 2,114,649) (фиг. S5) бяха синтезирани и субклонирани в pVG-mCherry плазмида, заместващ BglII-MscI Pпразнина промоторен фрагмент в pVG-mCherry, което води до pSDU30 (PBL1359-mCherry) и pSDU32 (PBL1694-mCherry) плазмиди, съответно (Thermo Fisher Scientific / Geneart GmbH). Ориентацията на двете последователности, използвани за клонирането, беше внимателно подбрана, за да се дешифрира PBL1359 и ПBL1694 промоторски дейности. Всички плазмиди носят ген за резистентност към спектиномицин като селективен маркер.

Култивиране и трансформация на щамове

Всички щамове бяха извлечени от Nestle Culture Collection (NCC, Nestlé Research, Лозана, Швейцария) и бяха рутинно култивирани в среда MRS, допълнена с 0,05% цистеин-HCl (MRSc), при анаеробни условия при 37 ° C, в затворен буркан, съдържащ саше AnaeroGen (ThermoFischer Scientific GmbH). B. longum NCC 2705 и Б. бреве ATCC 15,700 (T) електрокомпетентни клетки бяха приготвени по метода, описан по-рано от Serafini et al.20. Щамовете се отглеждат до стационарна фаза (инкубация за една нощ) в пресен MRSc, допълнен с 16% (wv−1) от късоверижни фруктоолигозахариди (scFOS) (Actilight®; Beneo-Orafti, Oreye, Белгия) при 37 ° C в анаеробиоза. Тази предкултура се разрежда 1:10 в 200 ml пресен MRSc бульон и 16% scFOS и се култивира при 37 ° C до OD600 nm от 0,6–0,7. Културите се охлаждат върху лед и клетките се събират чрез центрофугиране (2500 g за 10 минути), след това се промиват два пъти с 20 ml ледено студен промиващ буфер (16% FOS в 1 mM цитратен буфер, рН 6.0). Накрая клетките се ресуспендират в 800 µl (1/250 от първоначалния обем на културата) от същия ледено студен буфер. Аликвотни части от 80 верла се замразяват в течен азот и се съхраняват при -80°С до употреба. Клетките се размразяват върху лед и плазмидната ДНК (200 ng) се трансформира чрез електропорация в устройство Nucleofector и използвайки протокола AA-035, установен в апарата (RUWAG Handels AG, Bettlach, Швейцария). Електропорираните клетки се възстановяват в 1 ml пресен MRSc и се инкубират за 2-3 часа в анаеробиоза при 37 ° С преди посяването. Трансформиращите колонии се получават след 48 часа растеж при 37 ° C в анаеробиоза върху MRSc агар, съдържащ 200 µg ml−1 на спектиномицин (MRScs). Трансформантите се отглеждат анаеробно за една нощ при 37 ° в MRScs и се съхраняват при -80 ° C след добавяне на 20% глицерол (vv.−1).

Измерване на активността на β-глюкоронидаза

През нощта анаеробно отглеждани култури на B. longum NCC 2705, съдържащ плазмидите, носещи гена, кодиращ β-глюкоронидаза (gusA) под контрола на различни промотори бяха субкултивирани в 30 ml прясна среда на базата на MRSc без източник на въглерод (MRSc-C) (10 g l−1 бактопротеозен пептон № 3, 5 g l−1 екстракт от бакто дрожди, 1 g l−1 Tween 80 [all from Chemie Brunschwig, Buchs, Switzerland]2 г л−1 диамониев хидроген цитрат, 5 g l−1 натриев ацетат, 0,1 g l−1 магнезиев сулфат, 0,05 g l−1 манганов сулфат, 2 g l−1 динатриев фосфат, 0,5 g l−1 цистеин [all from Sigma-Aldrich Chemie GmbH]), към които са добавени 2% глюкоза или рафиноза. Експериментите за растеж бяха проведени в биологични три екземпляра, при 37 ° C при анаеробиоза и до средата на логаритмичната фаза (OD600 ~ 0,6). Всички среди съдържат 200 µg ml−1 на спектиномицин.

Клетките се събират от средно експоненциални култури чрез центрофугиране (2500 g за 10 минути при 4 ° C) и се концентрират до достигане на 12 OD600единици на ml в описания по-горе буфер за GusA-анализ33 състоящ се от 50 mM Na2 HPO4 (рН 7), 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 и 5 mM дитиотреитол (DTT). Клетките се разрушават механично с помощта на стъклени перли, за 3 пъти по 1 min при 4 m s−1 с помощта на FastPrep-24 (MP Biomedicals LLC, Ървайн, САЩ). Клетъчните остатъци се отстраняват чрез центрофугиране (3300 g, 5 минути, 4°C) и 100 л от клетъчния лизат се прехвърлят в 96 ямкови плаки, преди да се смесят със 100 (l 15 mM 4-нитрофенил β-D-глюкуронид (PNP) – GLUC; Sigma-Aldrich Chemie GmbH), разтворен в буфер за анализ. Плаките се инкубират при 37 ° С и абсорбцията се измерва при 405 nm на всеки 5 минути в продължение на 30 минути в спектрофотометър Varioskan (Thermo Fisher Scientific). Ензимната активност се изразява като нитрофенол наномола, освободен в минута.

Активност на промотора, измерена чрез определяне на нивото на флуоресценция

През нощта култури на B. longum NCC 2705, съдържащ плазмидите, кодиращи флуоресцентни протеини под контрола на различни промотори, се култивира, както е описано по-горе в MRSc-C, към което се добавят 2% от съответните захари (глюкоза, рафиноза, фруктоза, галактоза, рибоза, арабиноза или ксилоза). Прекултурите се извършват в същия състав на средата за предварително адаптиране на бактериалните клетки към съответните субстрати.

За да се определят нивата на циан-синьо Evoglow-Bs1, Bs2 и Pp1, клетките се промиват два пъти и се ресуспендират в 250 mM фосфатен буфер при рН 7.0. OD600 на суспензиите, както и флуоресценцията бяха измерени в Varioskan спектрофотометър (Thermo Fisher Scientific) без допълнителна инкубация. За всички варианти са използвани дължини на вълната на възбуждане и излъчване съответно от 450 и 495 nm.

За да се определят нивата на флуоресценция на протеина, изискващ кислород за узряване, клетките се центрофугират (3500 g за 2 минути), промиват се два пъти и се ресуспендират в 250 mM фосфатен буфер при pH 7,0, съдържащ бактериостатичния антибиотик хлортетрациклин (Sigma-Aaldrich ml at chemie 30 GmbH)−1 за спиране на протеиновия синтез. След това клетките се инкубират при стайна температура (в присъствието на кислород) за 90 минути и OD600и нивата на флуоресценция се измерват в спектрофотометър Varioskan (Thermo Fisher Scientific). Дължините на вълната на възбуждане и излъчване са следните: 470 и 625 nm за GFP, 436 и 480 nm за CFP, 500 и 535 nm за YFP и 545 и 610 nm за mCherry, съответно.

Статистически анализ

Статистически анализ и графично представяне на различните набори от данни за активиране на промотор бяха извършени с помощта на GraphPad prsm v8.1.1 (GraphPad Softwares, Сан Диего, САЩ). Представени са средните и стандартните отклонения, докато нивата на значимост са определени с помощта на еднопосочен ANOVA, последван от многократни сравнителни тестове на Sidak (α = 0,05).

Измерване на еволюцията на популацията чрез поточна цитометрия

Клетки, съдържащи pSDU30 (PBL1359-mCherry) и pSDU32 (PBL1694-mCherry) плазмидите се отглеждат в пресен MRSc-C, допълнен с 200 µg / ml спектиномицин и различни въглехидратни смеси (0,1% глюкоза: 0,5% арабиноза и 0,1% глюкоза: 0,5% галактоза, съответно). Десет (10) ml култури с ранна експоненциална фаза се разделят на аликвоти в по-малки обеми (1 ml) и се инкубират при 37 ° C в анаеробиоза за още 12 часа и се събират на равни интервали през цялата експоненциална фаза. Клетките се събират чрез центрофугиране (стайна температура, 3000 g, 2 минути) и се ресуспендират в 250 mM фосфатен буфер при pH 7.0, съдържащ 30 µg ml−1 Хлортетрациклин (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Швейцария). Разпределението на популацията се оценява чрез поточна цитометрия след 90 минути аеробна инкубация при 37 ° C, което съответства на оптималното време за узряване на протеина mCherry. Нивата на остатъчната глюкоза се определят в тези култури с помощта на комплекта MQuant (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) съгласно протокола на производителя и консумацията на въглехидрати се определя чрез HPLC (виж по-долу).

Анализите на поточна цитометрия бяха извършени с Beckman Coulter Cytoflex S (Beckman Coulter, Brea, САЩ), оборудван с четири лазера. Флуоресценцията на mCherry се измерва в ECD детектор (възбуждане при 561 nm, излъчване при 610/20 nm). Резултатите бяха анализирани със софтуера Beckman-Coulter CytExpert Acquisition версия 2.3. Всички данни бяха експортирани във формат FCS 3.0 и анализирани офлайн със софтуера De Novo FCSExpress версия 7.01.

Консумацията на въглехидрати, измерена чрез HPLC

Нивата на глюкоза, галактоза и арабиноза бяха количествено определени във филтрирани стерилни супернатанти на културата чрез високоефективна течна хроматография (HPLC, Agilent Technologies AG, Базел, Швейцария), като се използва колона Aminex HPX-87H (Bio-Rad Laboratories AG, Cressierland). Бяха инжектирани 5 ofl проби, като се използва 5 mM H2 ТАКА4разтвор като елуент, със скорост на потока 0,6 ml/min (време на работа 25 минути). Хроматограмата беше получена с помощта на детектор за индекс на пречупване, от който бяха изчислени пиковите площи и съответните концентрации.

Leave a Comment