Изследователите на HKUMed откриват по-ефективни варианти на CRISPR-Cas9 за приложения в генната терапия

Изследователски екип от Факултета по медицина на LKS, Университета на Хонг Конг (HKUMed) откри по-ефективни варианти на CRISPR-Cas9, които биха могли да бъдат полезни за приложения на генна терапия. Чрез установяването на нова тръбопроводна методология, която прилага машинно обучение при скрининг с висока пропускателна способност за точно предсказване на активността на протеиновите варианти, екипът разширява капацитета да анализира до 20 пъти повече варианти наведнъж, без да е необходимо да се събират допълнителни експериментални данни, което значително ускорява скоростта на протеиновото инженерство. Изследователският екип успешно е приложил тръбопровода в няколко оптимизации на Cas9 и е проектирал новиСтафилококус ауреусCas9 (SaCas9) варианти с подобрена ефективност на редактиране на гени. Констатациите вече са публикувани в Природни комуникации и е подадена заявка за патент въз основа на тази работа.

Заден план

Стафилококус ауреусCas9 (SaCas9) е чудесен кандидат за in vivo генна терапия поради малкия си размер, позволяващ опаковане в адено-асоциирани вирусни вектори, които да бъдат доставени в човешки клетки за терапевтични приложения. Въпреки това, неговата активност за редактиране на гени може да бъде недостатъчна за някои специфични локуси на заболяването. Допълнителните оптимизации на SaCas9 са от решаващо значение за прецизната медицина, преди да може да се използва като надежден инструмент за лечение на човешки заболявания. Такива оптимизации се състоят в повишаване на неговата ефективност и прецизност чрез промяна на протеина Cas9. Стандартният протокол за модифициране на протеина включва мутагенеза на насищане, където броят на възможните модификации, които могат да бъдат въведени в протеина, далеч надвишава експерименталния капацитет за скрининг дори на най-съвременните високопроизводителни платформи с порядъци.

В тази работа изследователският екип проучи дали комбинирането на машинно обучение със скрининг на библиотека с насочвана мутагенеза може да даде възможност за виртуален скрининг на много повече модификации за точно идентифициране на редките и по-добре представящи се варианти за по-нататъшни задълбочени валидации.

Изследвания

Изследователският екип тества рамката за машинно обучение на няколко публикувани преди това екрани за мутагенеза на варианти Cas9 и илюстрира, че машинното обучение може стабилно да идентифицира най-ефективните варианти, като използва само 5-20% от експериментално определените данни.

Протеинът Cas9 съдържа няколко части, включително протоспейсър съседен мотив (PAM)-взаимодействащи (PI) и Wedge (WED) домейни, за да се улесни взаимодействието му с целевия ДНК дуплекс. Изследователският екип комбинира машинното обучение и платформите за скрининг с висока производителност, за да проектира протеин SaCas9 с повишена активност чрез комбиниране на мутации в неговите PI и WED домейни, заобикалящи ДНК дуплекса, носещ a (PAM). PAM е от съществено значение за Cas9 за редактиране на целевата ДНК и идеята беше да се намали ограничението на PAM за по-широко насочване на генома, като същевременно се осигури протеиновата структура чрез засилване на взаимодействието с PAM-съдържащия ДНК дуплекс чрез WED домейна.

В екрана и последващите валидации изследователите идентифицираха нови варианти, включително един, наречен KKH-SaCas9-plus, с повишена активност с до 33% при специфични геномни локуси. Последвалият анализ на протеиновото моделиране разкри новите взаимодействия, създадени между WED и PI домейните на множество места в PAM-съдържащия ДНК дуплекс, приписвайки повишената ефективност на KKH-SaCas9-plus.

Изследователска значимост

Структурно ръководеният дизайн доминира в областта на инженеринга на Cas9; обаче, той изследва само малък брой места, аминокиселинни остатъци и комбинации. В това проучване изследователският екип показа, че може да се проведе скрининг с по-голям мащаб и по-малко експериментални усилия, време и разходи, като се използва подходът за скрининг на мултидомейн комбинаторна мутагенеза, свързан с машинно обучение, което ги накара да идентифицират нов високоефективен вариант KKH -SaCas9-плюс.

„Този ​​подход значително ще ускори оптимизирането на протеините Cas9, което би могло да позволи редактирането на генома да се приложи при лечението на генетични заболявания по по-ефективен начин“, каза д-р Алън Уонг Сиу-лун, асистент в Училището по биомедицински науки, HKUMed .

източник:

Препратки към списанието:

Thean, DGL, и др. (2022) Комбинаторна мутагенеза, свързана с машинно обучение, позволява ресурсно ефективно инженерство на дейности за редактор на геном CRISPR-Cas9. Nature Communications. doi.org/10.1038/s41467-022-29874-5.

.

Leave a Comment