Нов и ефективен метод за секвениране на вируса на Monkeypox

В скорошно проучване, публикувано в medRxiv* сървър за предпечат, испански изследователи описаха нов метод за обогатяване за метагеномно секвениране на вируса на маймунската шарка (MPXV).

Човешката маймунска шарка е зооноза, която произхожда от джунглите на Централна и Западна Африка и е докладвана за първи път в Демократична република Конго през 1970 г. Маймуните и гризачите разпространяват болестта, въпреки че първоначалният резервоар остава неизвестен. Хората се заразяват с MPXV инфекция чрез контакт със заразени животни/хора и замърсени материали. MPXV е вирус с обвивка с приблизително 197 kb двойноверижна (ds) ДНК.

MPXV принадлежи към рода Orthopoxvirus под Poxviridae семейство двуверижни ДНК вируси. Секвенирането на генома идентифицира две клади на MPXV: клади от басейна на Конго (CB) и западноафрикански (WA). CB класът причинява тежко заболяване и по-висока смъртност. Като цяло, поксвирусите (включително MPXV) проявяват по-голяма толерантност към широк диапазон на рН и са много по-устойчиви на изсушаване от другите вируси с обвивка. Освен това те са по-малко чувствителни към дезинфектанти от другите вируси с обвивка.

Проучване: Нов и ефикасен метод за обогатяване за метагеномно секвениране на вируса на маймунската шарка Кредит за изображение: NIAID

Относно изследването

В настоящото проучване изследователите оцениха нов метод за MPXV обогатяване на ДНК в сравнение с подхода без обогатяване. Бяха получени клинични проби от лезии или тампони с везикуларна течност и бяха избрани две MPXV-положителни проби (MP01 и MP03). Екстракцията на ДНК се извършва по два различни протокола.

При първия (без обогатяване) метод ДНК се екстрахира с помощта на MagNA чист компактен комплект за изолиране на нуклеинова киселина I. Вторият протокол се модифицира от базирана на сапонин техника за диференциален лизис и се центрофугира при висока g-сила (35 000 g). Този метод е предназначен за обогатяване на MPXV ДНК проби, за да се избегне загубата на квота за секвениране.

Първоначално беше извършен етап на меко центрофугиране (при ниска g-сила) за отстраняване на големи частици. ДНК на гостоприемника беше изчерпана с третирането със сапонин, натриев хлорид (NaCl) и дезоксирибонуклеаза (DNase). NaCl, ДНКаза и сапонин бяха отстранени за секвениране. Пробите бяха обработени с помощта на методите без обогатяване (MP01bCHUAC, MP03bCHUAC) и обогатяване (MP01CHUAC, MP03CHUAC).

Филогеномно дърво.  Филогеномен анализ на пробите от настоящото изследване, сравнявайки ги с всички пълни MPXV геноми, налични в GenBank до момента (2022-07-18, 275 генома от таксид 10244).  Това не се преструва, че прави извод за еволюцията на вируса, а само за да намери най-сходните записи с пробите в това изследване.  Цветна лента показва произхода на всяка проба (A: лилаво, A.1.1: жълто, A.2: зелено, B.1: синьо), а оранжевите области подчертават пробите от изследването.Филогеномно дърво. Филогеномен анализ на пробите от настоящото изследване, сравнявайки ги с всички пълни MPXV геноми, налични в GenBank до момента (2022-07-18, 275 генома от таксид 10244). Това не се преструва, че прави извод за еволюцията на вируса, а само за да намери най-сходните записи с пробите в това изследване. Цветна лента показва произхода на всяка проба (A: лилаво, A.1.1: жълто, A.2: зелено, B.1: синьо), а оранжевите области подчертават пробите от изследването.

Констатации

В предварителните резултати чрез системата за таксономична класификация Kraken 2, използвайки необработени нефилтрирани показания, авторите отбелязват, че повечето показания в обогатените проби (MP01CHUAC и MP03CHUAC) принадлежат на MPXV и почти нито едно не е класифицирано като замърсяване на гостоприемника. Обратно, повечето показания в необогатени проби (MP01bCHUAC и MP03bCHUAC) са на човешка ДНК.

Когато Best Match Tagger (BMTagger) отстрани човешката ДНК контаминация, броят на четенията за MP01CHUAC и MP03CHUAC намаля с 1% до 2%, докато намалението за MP01bCHUAC и MP03bCHUAC беше 90% до 95%. В последващата стъпка на контрол на качеството, всички показания, които не са класифицирани като Orthopoxvirus, бяха премахнати. Това доведе до по-малко драстична промяна и броят на четенията намаля с 30% за обогатени проби и 8% – 41% за необогатени проби.

В сравнение със суровите/оригиналните четения, броят на четенията след крайната стъпка за контрол на качеството намалява с 50% за обогатени проби и 93% – 98% за необогатени проби. Останалите показания бяха подравнени към референтна последователност, където показанията от обогатени проби имаха средна дълбочина от 1500 – 1800, докато тези от необогатени проби имаха средна дълбочина от 80 – 100.

Независимо от това, всички проби произведоха качествена консенсусна последователност на линията MPXV B.1. MP01CHUAC имаше една нуклеотидна мутация, докато MP03CHUAC имаше две аминокиселинни замествания срещу референтния геном.

Изводи

Проучването установи значителни разлики между двата протокола при сравняване на дълбочината и броя на четенията. Намаляването на броя на четенията, когато четенията на хост бяха премахнати, беше огромно (90% до 95%) за протокол без обогатяване, но незначително (1% до 2%) за протокол за обогатяване. В допълнение, методът на обогатяване запазва половината показания след крайната стъпка за контрол на качеството, докато протоколът без обогатяване запазва само 2% – 3% от първоначалните показания.

След подравняване на почистените показания към референтна MPXV последователност, средната дълбочина е по-висока за обогатените проби, отколкото за необогатените проби. Всички проби генерираха консенсус с добро качество въз основа на подравняване, но увеличената дълбочина (с протокол за обогатяване) е жизненоважна, за да се доверите на наблюдаваните генетични промени.

В заключение, новият метод за обогатяване значително подобри ефективността на секвенирането, броя на вирусните четения, дълбочината и надеждността на консенсусните последователности. По-специално, премахването на последователностите на хоста преди секвенирането позволява включването на повече проби на касета, намалявайки разходите и времето за диагностика и повишавайки ефективността на секвенирането.

*Важно съобщение

medRxiv публикува предварителни научни доклади, които не са рецензирани от партньори и следователно не трябва да се считат за убедителни, да ръководят клиничната практика/поведение, свързано със здравето, или да се третират като установена информация.

.

Leave a Comment