Проучването установява, че протеинът SARS-CoV-2 E антагонизира антивирусните реакции, медиирани от BET протеин по време на инфекция

В скорошно проучване, публикувано в Доклади за клеткиизследователите оценяват въздействието на протеина на обвивката (E) на тежък остър респираторен синдром на коронавирус 2 (SARS-CoV-2) върху протеините на бромодомена и екстратерминалния домен (BET).

Проучвания: Вирусният E протеин неутрализира медиирания от BET протеин антагонизъм след влизане на SARS-CoV-2. Кредит на изображението: Йети с точки / Shutterstock

Заден план

Семейството протеини BET включва гени BRD2, BRD3, BRD4 и BRDT. Известно е, че взаимодействието на BET протеините с хистони, както и клетъчните транскрипционни машини са от съществено значение за няколко клетъчни функции като ремоделиране на хроматин, клетъчна пролиферация и генна експресия. Различни проучвания показват, че BRD2 играе важна роля като регулатор на транскрипцията на ангиотензин-конвертиращия ензим 2 (ACE2). По този начин, използването на BET инхибитори може да намали експресията на ACE2 и последващата инфекция със SARS-CoV-2

Относно проучването

В настоящото проучване изследователите анализираха функцията на BET протеините по време на инфекция със SARS-CoV-2.

Ролята след влизане на съответните BET протеини се оценява чрез изчерпване на клетките A549, които свръхекспресират ACE2 (A549-ACE2). Екипът разработи поликлонални нокаут (KO) клетки на BRD3 и BED2, както и нокдаун (KD) клетки на BRD4 чрез нуклеофекция на клъстерирани редовно взаимно разположени къси палиндромни повторения (CRISPR) -Cas9 рибонуклеопротеинови (RNP) комплекси. Нуклеофекцията включва множество насочващи рибонуклеинови киселини (РНК) срещу всяка цел. Контролните клетки бяха включени с RNP комплекси без РНК водач. Екипът потвърди изтриването на BET протеини чрез Western blotting, преди клетките да бъдат заразени със SARS-CoV-2.

Екипът също генерира KO и KD BET протеини в Calu3 клетки и епителни клетки на дихателните пътища, имащи експресия на ACE2, която е достатъчна за поддържане на вирусна инфекция. KD и KO бяха допълнително валидирани чрез Western blotting на експресията на BET протеин, последвано от инфекция със SARS-CoV-2. Влиянието на изчерпването на BET протеините върху производството на интерферон по време на инфекции със SARS-CoV-2 беше тествано чрез заразяване на клетки Calu3 и анализиране на експресията на информационната РНК (mRNA) на интерферон-β (IFNB1), цитокин интерлевкин 6 (IL6) и интерферон-стимулиран ген 15 (ISG15). Освен това, екипът използва Calu3 BET KD и KO клетките, за да провери дали изчерпването на BET протеините причинява потискане на генната индукция.

Въздействието на SARS-CoV-2 E протеиновите фенокопи върху BET инактивирането беше оценено чрез трансфектиране на експресионна конструкция на E протеин или празен контролен вектор (EV) в A549, за да се стимулира производството на интерферон.

Резултати

Резултатите от проучването показват, че изчерпването на BRD3 и BRD4 значително намалява титрите на вирусната РНК, свързани с клетките, както и производството на инфекциозни частици в анализите на плаките. Освен това, само BRD4 KD повишава вирусната репликация в клетки, които са били заразени със SARS-CoV-2 при множественост на инфекцията (MOI) от 0,01, докато BRD2 KO също повишава вирусната инфекция при всички MOI до сравнително по-малка величина. Това предполага, че BET протеините играят различни функции при инфекции със SARS-CoV-2.

Екипът също така наблюдава, че BRD2 KO клетките намаляват нивата на транскрипция на ACE2 с приблизително 80%, което води до спад в нивата на вирусната РНК, както и на инфекциозните вирусни титри. BRD3 KO също намалява експресията на АСЕ с почти 50% и вирусната репликация приблизително три пъти. Като цяло, екипът установи, че BDR4 KD показва най-нисък ефект върху експресията на вирусни РНК, но увеличава производството на инфекциозни частици. Това подчертава въздействието на BET протеиновите клетки върху стъпките преди и след влизането, участващи в инфекцията със SARS-CoV-2.

Освен това, екипът открива стабилни индукции на гените IFNB1, IL6 и ISG15 сред контролните клетки, свързани с увеличаване на MOI. От друга страна, експресията на тези гени значително намалява след третирането с JQ1 или dBET6. Освен това инфекцията със SARS-CoV-2 на контролните клетки само за RNP показва силна стимулация на трите гена във всички MOI. Въпреки това, загубата на всички BET протеини води до забележително намаляване на експресията на гените при ниски MOI. По-специално, инцидентът с изчерпване на BET при по-високи MOI също намалява индукцията на IL6 и IFNB1, докато експресията на ISG15 не показва никакво намаляване на клетките със загуба на BRD3 и BRD4.

Екипът също така установи, че протеинът SARS-CoV-2 E взаимодейства с BRD2, както и с BRD4. Генерирането на маркирани със стрептокок, нулеви на ацетилиране мутанти на Е протеина, а именно K53R, K63R и K53 / 63R, показа, че мутантът K53 / 63R намалява свързването с BRD2, което предполага, че Е протеинът улеснява взаимодействието с BRD2.

Заключение

Като цяло, резултатите от проучването подчертават антивирусната функция, изпълнявана от BET протеините по време на хода на инфекция със SARS-CoV-2 и тяхната отделна роля в различните етапи от живота на вируса. Изследователите призовават за повишено внимание по отношение на клиничната употреба на pan-BET инхибитори при лечението на хора, заразени със SARS-CoV-2.

.

Leave a Comment