Antimykotikum Bifonazol als antivirales Mittel gegen SARS-CoV-2

In einer kürzlich in der Zeitschrift veröffentlichten Studie Molekulare Therapieidentifizierten die Forscher Bifonazol, ein Antimykotikum auf Imidazolbasis, das eine starke Aktivität gegen das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) aufweist, indem sie ein Hochdurchsatz-Screening kleiner Moleküle verwendeten.

SARS-CoV-2 infiziert Wirtszellen durch Wechselwirkungen der Spike (S)-Protein-Rezeptor-Bindungsdomäne (RBD) und Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2)-Rezeptoren des Wirts. Daher ist die S-RBD-ACE2-Bindungsstelle ein potenzielles Ziel für die Entwicklung von Anti-SARS-CoV-2-Therapien.

Studien: Identifizierung des von der FDA zugelassenen Bifonazols als SARS-CoV-2-Blocker nach einem Bioreporter-Medikamentenscreening. Bildnachweis: NIAID

Über das Studium

In der vorliegenden Studie untersuchten die Forscher die Verwendung kleiner Moleküle in Anti-SARS-CoV-2-Therapeutika, indem sie die Wirksamkeit kleiner Moleküle identifizierten und verglichen, die S RBD-ACE2-Wechselwirkungen blockierten.

Das Team verwendete einen Split-Luciferase-Assay zum Screening kleiner Moleküle, die die Bindung von S RBD-ACE2 hemmen. Der Assay basierte auf der NanoLuc Binary Technology (NanoBiT), bei der der Nanoluciferase-Bioreporter in zwei Teile zerlegt wurde, nämlich das Small BiT (SmBiT) und das Large BiT (LgBiT), die eine robuste Konformationsstabilität aufwiesen und dadurch eine ideale Aufteilung erzeugten Reporter zur Untersuchung der S-RBD-ACE2-Wechselwirkungen. In dem Assay ergab die S RBD-ACE2-Bindung starke und stabile lumineszierende Nano-Luciferase-Signale nach Zugabe des Coelenterazin (CTZ)-Substrats.

© 2022 Die Amerikanische Gesellschaft für Gen- und Zelltherapie

Humane embryonale Nierenzellen 293 (HEK 293) wurden transfiziert, um die Proteine ​​LgBiT-RBD und SmBiT-ACE2 zu exprimieren. Darüber hinaus zeigten LgBiT-RBD-Wechselwirkungen mit Anti-S-RBD-Antikörpern oder SmBiT-ACE2-Wechselwirkungen mit löslichem ACE2 (sACE2) eine kompetitive Hemmung und beeinträchtigten die Lumineszenzsignale. Insgesamt 1.200 von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassene Wirkstoffe der Prestwick-Bibliothek wurden mit zwei Methoden A und B gescreent.

In Methode A wurde die Verbindungsbibliothek zu dem LgBiT-RBD/SmBiT-ACE2-Komplex hinzugefügt, um Verbindungen zu identifizieren, die den Komplex dissoziierten. In Methode B wurde die Bibliothek dem LgBiT-RBD-Komplex hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von SmBiT-ACE2, um Verbindungen zu identifizieren, die die S-RBD-ACE2-Wechselwirkungen hemmten. Treffer mit einer Bioreporter-Lumineszenz von ≤ 15 % wurden aus der Analyse eliminiert und Verbindungen mit den 45 besten Treffern wurden weiter analysiert.

Die Wirksamkeit der Verbindungen wurde in ACE2- und Transmembran-Serinprotease 2 (TMPRSS2)-exprimierenden VeroE6-Zellen, die mit SARS-CoV-2 S-pseudotypisiertem Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV) infiziert waren, das grün fluoreszierendes Protein (VSV-GFP-S) exprimiert, bewertet Wildtyp (wt) VSV-GFP. Anschließend wurden Immunfluoreszenz-Bildgebung und Zelllebensfähigkeitsbewertungen durchgeführt. Außerdem wurde die Wirksamkeit von Bifonazol bei K18-ACE2-Mäusen untersucht.

Diagramme, die % GFP-Foci für wtVSV und VSV-S über alle Arzneimittelkonzentrationen hinweg angeben, wurden aufgetragen, um die Spezifität der Verbindungen zu bewerten. Zusätzlichin silico Es wurden molekulare Docking-Analysen und bimolekulare Fluoreszenzkomplementationstests (BiFC) durchgeführt und die Spiegel der SARS-CoV-2-Boten-Ribonukleinsäure (mRNA) bewertet.

Ergebnisse

Unter den 1.200 gescreenten Verbindungen zeigte Bifonazol (Prestw-1241) die stärkste kompetitive Hemmung der SARS-CoV-2 S RBD-ACE2-Wechselwirkungen mit beiden Methoden, mit einer Abnahme der Bioreporter-Signale um 46 % und 51 % bei den Methoden A und B bzw. In Silico Die molekulare Docking-Analyse zeigte, dass Bifonazol an den N-terminalen kleinen Lappen von ACE2 um den K353-Rest herum gebunden war, was zur Verhinderung der RBD-ACE2-Bindung führte.

Bifonazol reduzierte signifikant die pseudotypisierten VSV-S-GFP-infizierten Zellen [half-maximal inhibitory concentration (IC50) = 30 to 40 µM, without toxicity up to 100 µM] und wtVSV-GFP-infizierte Zellen (IC50 = 60 bis 70 µM). Bei intranasaler Verabreichung führte Bifonazol zu einer 40-prozentigen Verringerung der Letalität bei mit VSV S herausgeforderten K18-ACE2-Mäusen mit ähnlichen Vorteilen nach der Herausforderung wie bei lebendem SARS-CoV-2.

Die Spezifitätskurven von Bifonazol zeigten einen Aufwärtstrend von 20 bis 67 μM, was auf das Potenzial der Verbindung zur VSV-S-Hemmung hinweist. Bifonazol reduzierte auch die SARS-CoV-2-mRNA-Spiegel, reduzierte die Viruslast in der mittleren Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50)-Assay und reduzierte Immunfluoreszenzfärbung für SARS-CoV-2 S. Zytotoxizitätsassays bestätigten keine Auswirkung von Bifonazol auf die Zelllebensfähigkeit, wie in den VeroE6-hTMPRSS2-Zellen bei den getesteten Dosen beobachtet wurde. Darüber hinaus zeigte Bifonazol eine signifikant reduzierte Lumineszenz von mutierten RBD-Bioreportern, was auf eine erhebliche Hemmung von SARS-CoV-2-Varianten (insbesondere Omicron), die an ACE2 binden, durch Bifonzaole hinweist.

Der BiFC-Assay zeigte eine dosisabhängige Abnahme der Fusion von TMPRSS2/ACE2-exprimierenden Zellen und S-exprimierenden humanen embryonalen Nierenzellen (HEK293T) unter Bifonazol-Behandlung. Ähnliche Wirkungen wurden bei der Verwendung von S von SARS-CoV mit einer Hemmung von SARS-CoV mit RBD-ACE2-Wechselwirkungen von 45 % und 22 % unter Verwendung der Methoden A bzw. B beobachtet. Dies weist darauf hin, dass Bifonazol auch eine antivirale Aktivität gegen SARS-CoV besitzt.

Neben anderen Verbindungen reduzierten Nicardipin und Ethinylestradiol signifikant Bioreporter-Signale mit vergleichbarer Bioreporter-Beeinträchtigung zwischen Bifonazol und Nicardipin (IC50 = 1,9 µM), Cisaprid (IC50 = 16,5 µM) und Ethinylestradiol (IC50 = 2,6 µM). Nicardipin und Ethinylestradiol hemmten wtVSV-GFP (IC50 = 15 bis 20 µM) effizienter als VSV-S-GFP (IC50 = 25 bis 70 µM). Cisaprid beeinflusste die VSV-Infektion nicht und war bei Dosen von > 20 µM toxisch. Die Spezifitätskurven für Nicardipin und Ethinylestradiol zeigten einen Abwärtstrend, was auf eine verstärkte wtVSV-Hemmung und eine geringere S-Spezifität hinweist.

Beim Wirkstoffscreening blockierten andere Imidazol-Antimykotika (Econazol, Ketoconazol, Clotrimazol, Oxiconazolnitrat) und ein Imidazol-Entzündungshemmer, Tribenosid, die S-RBD-ACE2-Wechselwirkungen. Econazol (IC50 = 2,3 µM) und Ketoconazol (IC50 = 14,5 µM) zeigten eine Beeinträchtigung des Bioreporters und Aufwärtstrends in den Spezifitätskurven, wenn auch bei hohen Konzentrationen von 60 bis 80 µM.

Fazit

Insgesamt hob die gefundene Studie das vielversprechende Potenzial von Bifonazol als Anti-SARS-CoV-2-Therapeutikum mit hoher Wirksamkeit und Spezifität für die SARS-CoV-2-Hemmung hervor, indem es kompetitiv an ACE2 bindet und anschließend die S RBD-ACE2-Wechselwirkungen blockiert.

Zeitschriftenreferenz:

  • Taha Z, Arulanandam R, Maznyi G, Godbout E, Carter-Timofte ME, Kurmasheva N, Reinert LS, Chen A, Crupi MJF, Boulton S, Laroche G, Phan A, Rezaei R, Alluqmani N, Jirovec A, Acal A, Brown EEF, Singaravelu R, Petryk J, Idorn M, Potts KG, Todesco H, John C, Mahoney DJ, Ilkow CS, Giguère P, Alain T, Côté M, Paludan SR, Olagnier D, Bell JC, Azad T, Diallo JS , Identifizierung des von der FDA zugelassenen Bifonazols als SARS-CoV-2-Blocker nach einem Bioreporter-Medikamentenscreening, Molecular Therapy (2022), DOI: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2022.04.025, https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1525001622002969

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