Die N-terminale Domäne von SARS-CoV-2 moduliert die S1/S2-Spaltung und Spike-vermittelte Funktionen

In einer kürzlich veröffentlichten Studie bioRxiv* Preprint-Server untersuchten die Forscher die Rolle der N-terminalen Domäne (NTD) des Spike (S)-Proteins des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-COV-2) bei der SARS-CoV-2-Fusion mit den Wirtsmembranen und dem Coronavirus Krankheit 2019 (COVID-19).

Studien: Die N-terminale Domäne des SARS-CoV-2-Spikes moduliert den TMPRSS2-abhängigen Viruseintritt und die Fusogenität. Bildnachweis: Gepunkteter Yeti / Shutterstock

SARS-CoV-2 bindet an das Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2) des Wirts, um den Viruseintritt basierend auf der transmembranen Serinprotease 2 (TMPRSS2)-Expression und S-Spaltung einzuleiten. In der NTD des SARS-CoV-2-Spikes wurden über 20 Mutationen identifiziert, aber nur sehr wenige wurden charakterisiert. Daher ist die Auswirkung von Mutationen auf die virale Infektiosität und die Immunogenität von Impfstoffen unklar.

Die Autoren der vorliegenden Studie hatten zuvor gezeigt, dass Delta S und Kappa S im Vergleich zum Stamm 614G WT (Wildtyp) eine hohe S1/S2-Spaltungseffizienz zeigten und die Infektiosität des SARS-CoV-2-Stamms mit der Effizienz korrelierte S-Spaltung.

Über das Studium

In dieser neuen Studie bewerteten die Forscher die Bedeutung von NTD bei der SARS-CoV-2-S-Spaltung und Fusion des Virus mit Wirtszellen, was zu nachfolgenden SARS-CoV-2-Infektionen führt.

Das Team konstruierte ein Panel von chimärem S, das entweder Kappa NTD oder Delta NTD mit ihren entsprechenden elterlichen Stammhintergründen umfasste. Anschließend wurden Pseudoviren (PV), die S von mehreren besorgniserregenden Varianten (VOC) exprimieren, verwendet, um die TMPRSS2-exprimierenden 293T-Zellen und parentalen 293T-Zellen zu transduzieren, um die Wirksamkeit der SARS-CoV-2-Invasion zu bewerten. Zusätzlich wurde der Unterschied in der Fusogenität der Delta- und Kappa-Stämme bewertet.

Als erweiterte Analyse wurde das WT S mit entweder Delta NTD oder Kappa NTD ausgedrückt. Darüber hinaus wurde Delta NTD in die Unterlinien Omicron BA.1 und BA.2 eingeführt, um festzustellen, ob Delta NTD die Fusogenität von Omicron erhöhen könnte. Außerdem wurden die Auswirkungen von BA.2 NTD auf die Fusogenität von BA.1 und umgekehrt bewertet.

Der Beitrag von NTD zur S-Spaltung wurde in gereinigten PVs durch Western-Blot-Analyse bewertet. Darüber hinaus wurde die Abhängigkeit von SARS-CoV-2 von TMPRSS2 für die Wirtsinvasion durch Vorbehandlung von A549-ACE2/TMPRSS2-Zellen oder Organoiden der Atemwege mit entweder E64D (einem Cathepsin-Inhibitor) oder Camostat (einem TMPRSS2-Inhibitor) bewertet. Die Veränderung der ACE2-Zugänglichkeit im chimären S wurde durch Transduktion von parentalen 293T-Zellen mit aufgehobener TMPRSS2-Expression und Überexpression von ACE2 bewertet.

Der Beitrag von Delta-NTD-Mutationen zur Erhöhung der viralen Infektiosität wurde in kultivierten menschlichen Atemwegsepithelzellen (Calu3) bewertet, die mit PVs behandelt wurden, die S verschiedener VOCs exprimieren, und die Reversion von Aminosäureclustern (156G, 142D, del158R und del157F) zum WT Wuhan -1 Belastung.

Um die Auswirkung der Reversion von Mutationen auf die Impfstoffempfindlichkeit zu bewerten, wurden die PVs zur Transduktion von HeLa-ACE2-Zellen mit Reihenverdünnung von Serumproben verwendet, die von Personen erhalten wurden, die doppelt mit dem BNT162b2-Impfstoff geimpft wurden. Zusätzlich wurden virale Neutralisationsassays durchgeführt.

Das SARS-CoV-2 Delta NTD erhöht die Fusionskinetik von Kappa- und WT-Spikes.  (A): Ein schematisches Diagramm, das das geteilte GFP-System für die Spike-ACE2-vermittelte Zellfusion zeigt.  (B): 681R oder 681H ist für die verstärkte Fusogenität in Delta und seiner Chimäre, die Kappa NTD trägt, erforderlich.  (C): Das fusionierte Delta NTD in Kappa und WT erhöhte jeweils die Fusionskinetik ihrer Gegenstücke.  Die Liniendiagramme auf der rechten Seite zeigen den Prozentsatz des positiven GFP-Bereichs 12, 14, 16, 20, 22 und 23 Stunden nach der Transfektion.  Die Daten, die das SEM an jedem Punkt zeigen, wurden aus zwei Experimenten gemittelt.  Die Heatmap zeigt zu jedem Zeitpunkt den Mittelwert des GFP-positiven Bereichs über das Sichtfeld aus zwei Experimenten.

Das SARS-CoV-2 Delta NTD erhöht die Fusionskinetik von Kappa- und WT-Spikes. (A): Ein schematisches Diagramm, das das geteilte GFP-System für die Spike-ACE2-vermittelte Zellfusion zeigt. (B): 681R oder 681H ist für die verstärkte Fusogenität in Delta und seiner Chimäre, die Kappa NTD trägt, erforderlich. (C): Das fusionierte Delta NTD in Kappa und WT erhöhte jeweils die Fusionskinetik ihrer Gegenstücke. Die Liniendiagramme auf der rechten Seite zeigen den Prozentsatz des positiven GFP-Bereichs 12, 14, 16, 20, 22 und 23 Stunden nach der Transfektion. Die Daten, die das SEM an jedem Punkt zeigen, wurden aus zwei Experimenten gemittelt. Die Heatmap zeigt zu jedem Zeitpunkt den Mittelwert des GFP-positiven Bereichs über das Sichtfeld aus zwei Experimenten.

Ergebnisse

In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen des Teams über die Assoziation von erhöhter S-Spaltung mit erhöhter Fusogenität und Infektiosität wurden eine verstärkte TMPRSS2-vermittelte S1/S2-Spaltung und eine erhöhte Infektiosität bei den Kappa- und Delta-Chimären in den Organoiden der Atemwege und den Calu3-Zellen beobachtet. Darüber hinaus war Kappa S anfällig für SARS-CoV-2 S1-Ausscheidung mit einem höheren S2 / S1-Verhältnis im Vergleich zum WT-Stamm, bei dem Delta S eine erhöhte Stabilität zeigte. Darüber hinaus zeigte Delta die höchste Effizienz des TMPRSS2-vermittelten SARS-CoV-2-Eintritts und der Fusogenität. Interessanterweise wurde eine erhöhte Eintrittseffizienz des chimären Kappa-S beobachtet, was darauf hindeutet, dass Delta NTD den Eintritt von Kappa in den Wirt durch die Verwendung von TMPRSS2 ermöglichte.

Im Gegensatz dazu zeigten Omicron-Unterlinien mit Delta NTD keine Zunahme der Fusogenität, was darauf hindeutet, dass Delta NTD die TMPRSS2-Nutzungseffizienz von Omicron nicht erhöhen konnte. In der erweiterten Analyse verstärkten Delta NTD und Kappa NTD die S-Spaltung in den WT-Chimären und erhöhten dadurch die WT-Infektiosität in den Calu3-Zellen.

In den vorbehandelten Zellen und Atemwegsorganoiden ist die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) Der Wert von Camostat war für Delta doppelt so hoch wie für Kappa, während E46D vernachlässigbare Auswirkungen auf SARS-CoV-2 zeigte. Delta zeigte eine erhöhte Resistenz gegenüber Camostat und zeigte daher eine höhere TMPRSS2-Nutzungseffizienz zur Initiierung des Viruseintritts.

Bei ACE2-Überexpression wurde ein 30-facher bzw. ein vierfacher Anstieg der Delta- und Kappa-Effizienz beobachtet. Bemerkenswerterweise zeigte das chimäre Kappa-S, das Delta NTD trägt, einen ähnlichen Grad an Empfindlichkeitssteigerung wie Delta. Andererseits wurde bei der Delta-Chimäre, die Kappa NTD trägt, eine verringerte Abhängigkeit von ACE2 beobachtet. Dies deutete darauf hin, dass Delta NTD die TMPRSS2-vermittelte S-Spaltung und die allosterisch regulierte RBD für eine erhöhte ACE2-Nutzungseffizienz modulierte

Jede revertierte Mutante zeigte eine verringerte Infektiosität in Calu3-Zellen, wobei die höchste (dreifache) Verringerung nach dem erneuten Einfügen von 157R/158R beobachtet wurde. Bemerkenswert ist, dass die Verringerung der Infektiosität nur in Calu3-Zellen und nicht in Hela-ACE2-Zellen beobachtet wurde, was auf die SARS-CoV-2-Spezifität hinweist, die durch die NTD verliehen wurde.

In den Neutralisationsassays erhöhte das Vorhandensein von G156E und D142G und die Reparatur der 157F/158R-Deletion die SARS-CoV-2-Neutralisationsempfindlichkeit um das Zweifache, was die Bedeutung von NTD für die Umgehung der Immunantwort des Wirts und die Infektiosität von SARS- CoV-2.

In den Fusionsassays verschob sich der Fusionsphänotyp beim Fusionieren von Kappa NTD in Delta von Delta zu Kappa, mit Verzögerung der Kinetik. Andererseits wurde beim Austausch von Delta NTD gegen Kappa ein schnell fusionierender Delta-Phänotyp beobachtet. Außerdem wurde ein schnellerer Fusionsphänotyp beim Fusionieren von Delta NTD in das WT-Rückgrat beobachtet. Dies deutete darauf hin, dass Delta NTD die Fusionskinetik der WT- und Kappa-Stämme verbessern könnte.

Insgesamt hoben die Studienergebnisse die variantenspezifische allosterische Modulation der SARS-CoV-2 S-Spaltung und Infektiosität durch NTD hervor. Die Erhöhung der S-Spaltungseffizienz rechtfertigte eine verwandte NTD, da das S, das nur Mutationen in der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) trug, nicht effizient gespalten werden konnte.

* Wichtiger Hinweis

bioRxiv veröffentlicht vorläufige wissenschaftliche Berichte, die keinem Peer-Review unterzogen wurden und daher nicht als schlüssig angesehen werden sollten, die klinische Praxis / gesundheitsbezogenes Verhalten leiten oder als etablierte Informationen behandelt werden sollten.

Zeitschriftenreferenz:

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